Kryo-Elektronenmikroskopie und Einzelpartikelanalyse

Im Rahmen des berlin-brandenburger Forschungsverbunds “Ultrastrukturnetzwerk“ (USN), der vom MPIMG gemeinsam mit Christian Spahn (Charité Berlin) und Roland Beckmann (Charité Berlin, jetzt LMU München) initiiert wurde, haben wir eine Facility für hochauflösende Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) aufgebaut. Der Schwerpunkt unserer Arbeit liegt hier auf der Strukturbestimmung makromolekularer Proteinkomplexe mittels Kryo-EM in Kombination mit der Einzelpartikelanalyse. Hierfür stellt unsere Facility die technologische Plattform für Proben-Screening, Einbettung der Proben in vitrifiziertes Eis und automatische Datensammlung bis hin zur Computerinfrastruktur für die Bildverarbeitung zur Verfügung. Core-Instrument unserer Facility ist ein 300 kV Tecnai G2 Polara Kryo-Elektronenmikroskop (FEI), das mit einer 2kx2k Orius CCD und einer k2summit DED-Kamera (Gatan) ausgestattet ist.

 

Abbildung 1: Kryo-EM Struktur des Subzustands I (TIPRE) (a) bzw. II (TIPOST) (b) des T. thermophilus 70S•EF-G•GDP•FA Komplexes abgebildet aus Richtung des  L7-stalks (gelb: 30S Untereinheit; blau: 50S Untereinheit; rot: EF-G; grün: tRNA). Der Vergleich der beiden Zustände nach Alignierung auf die 50S-Untereinheit zeigt eine Verdrehung der 30S Untereinheit (c). Die Alignierung der Subzustände auf die Plattform der 30S Untereinheit verdeutlicht die Konformationsunterschiede aufgrund der Kopf-Rotation (“head swiveling“, d). Die 30S-Untereinheit des Subzustands I (TIPRE) ist in orange, die 30S-Untereineit des Zustands II (TIPOST) in gelb dargestellt (Ratje et al., 2010, Nature).

Im Gegensatz zu konventionellen röntgenkristallographischen Methoden müssen Proteinkomplexe bei der Einzelpartikelanalyse nicht erst aufwendig kristallisiert werden, sondern werden unter nahezu physiologischen Bedingungen in amorphes Eis eingebettet und mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie abgebildet. Die 3D-Stuktur der Molekülkomplexe erhält man dabei durch Mittelung über tausende bis zu mehreren hunderttausende Projektionsbildern einzelner Moleküle, die als “Partikelbilder“ bzw. kurz “Partikel“ bezeichnet werden. Die Methode basiert dementsprechend auf der Annahme, dass die abgebildeten Moleküle alle identisch sind. In der Praxis hat sich aber gezeigt, dass selbst biochemisch reine Präparationen von Proteinkomplexen in der Regel noch eine variable Zusammensetzung besitzen und verschiedene Konformationszustände einnehmen können und daher als heterogene Proben betrachtet werden müssen. Es ist mittlerweile sogar allgemein akzeptiert, dass die unterschiedlichen Konformationszustände häufig Intermediate einer metastabilen Energielandschaft (“metastable energy landscape“) darstellen und die Verschiebung dieser Energielandschaft durch z.B. Ligandenbindung oder Hydrolyse von Nukleotiden die Grundlage für die biologische Funktion dieser Komplexe ist (Munro et al., 2009, Trends Biochem Sci).

Im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 740 (Projekt Z1) arbeiten wir an der Implementierung neuer Methoden, um die drei Hauptprobleme der Einzelpartikelanalyse zu überwinden, nämlich Probenheterogenität, der große Bedarf an Daten sowie den typischerweise sehr niedrigen Kontrast von Kryo-EM Aufnahmen. Zusammen mit C. Spahn (IMPB, Charité Berlin) testen wir Multipartikel-Refinement-Strategien, die in seiner Gruppe entwickelt werden (Loerke et al., 2010, Methods Enzymology), um die Probenheterogenität mit Bildverarbeitungsmethoden in-silico zu analysieren. Mit diesen Methoden konnten wir heterogene Datensätze sowohl von bakteriellen als auch von  eukaryotischen ribosomalen Komplexen in Sub-Populationen sortieren, die unterschiedliche funktionelle oder konformationelle Zustände repräsentieren. Auf diese Weise konnten wir sogar zahlreiche neue Funktionszustände der Proteinbiosynthese wie z.B. einen neuen pe/E hybrid-Zustand, der eine partiell translozierte tRNA aufweist (Abb. 1, Ratje et al., 2010, Nature), eine große Drehbewegung der 30S-Unterheit (Ramrath et al., 2012, Nature), neue Translokations-Intermediate (Ramrath et al., 2013, PNAS), spontane tRNA-Bewegungen in eukaryotischen PRE-80S Ribosomen (Budkevich et al., 2011, Mol. Cell) sowie eine Rotation der Untereinheiten in PRE und POST-Komplexen von Säugetier-Ribosomen (Budkevich et al., 2014, Cell) identifizieren. Darüber hinaus konnten wir weitere Strukturen ribosomaler Komplexe bestimmen, die z.B. an der IRES-vermittelten Initiation (Yamamoto et al., 2014, Nat Struct Mol Biol) bzw. der Termination der Proteinbiosynthese beteiligt sind (Muhs et al., 2015, Mol. Cell).

 

Abbildung 2: Hochauflösende Kryo-EM Elektronendichtekarte (gefiltert bei 3.5 Å) von humanen Ribosomen im POST-Zustand (A) und die entsprechenden atomare Modelle der ribosomalen Untereinheiten (B). (C–F) Ausgewählte Regionen der Kryo-EM Dichtekarte zeigen deutlich aufgelöste a-Helices (C), b-Faltblattstrukturen (D) inklusive Aminosäureseitenketten bzw. p-Stacking Wechselwirkungen (E) sowie einzelne Nukleotide inklusive gebundener Metallionen (F, Behrmann et al., 2015, Cell).

Das Sortieren von Daten mittels Multipartikel-Refinement erfordert allerdings immer größere Datensätze mit bis zu einer Millionen und mehr Partikeln. Wir haben setzen daher sowohl an  unserem Tecnai Spirit als auch am Tecnai Polara Mikroskop das Leginon-System (Suloway et al., 2005, J Struct Biol) zur automatischen Datensammlung ein und können damit routinemäßig bis zu 20000 Kryo-EM Aufnahmen pro Woche sammeln. Wir setzen Leginon außerdem zur automatischen Aufnahme von Tilt-Paaren für die “Random Conical Tilt“-Analyse und tomographischer Kippserien ein. Ein bahnbrechender technologischer Durchbruch für die Kryo-EM war die Entwicklung direkter Elektronendetektoren (DEDs). Im Gegensatz zu Szintillator-basierten Kamerasystemen registrieren DEDs eintreffende Elektronen direkt auf dem Chip und erreichen daher eine deutlich höhere Sensitivität und ein dramatisch besseres Signal-zu-Rausch Verhältnis.

Durch Kombination von automatischer Datensammlung, Multipartikel-Refinement und dem Einsatz von DED-Kameras konnten wir kürzlich mehr als 10 verschiedene funktionelle Zustände in ex-vivo isolierten humanen Polysomen identifizieren und die Struktur des Zustands mit der höchsten Besetzung, den 80S-POST-Komplex, mit nahezu atomarer Auflösung bestimmen (Abb. 2, Behrmann et al., 2015, Cell). Im Mai 2015 haben wir eine Gatan K2summit DED an unserem Polara installiert und arbeiten zur Zeit auch an der Strukturbestimmung von kleineren Proteinkomplexen wie RNA-Polymerasen (Kooperation mit M. Wahl, FU-Berlin) oder dem pflanzlichen DPE2-Komplex.

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