Konventionelle zellbiologische TEM-Anwendungen und korrelative Mikroskopie

Neben dem Support im Bereich der Lichtmikroskopie umfassen die meisten unserer Kooperationen innerhalb des Instituts zellbiologische TEM-Anwendungen wie das Ultradünnschneiden von Zellen und Geweben zur Visualisierung unterschiedlicher zellulären Komponenten. Dies können sowohl konkrete Einzelprojekte mit sehr spezifischen Fragestellungen als auch langjährige Zusammenarbeiten sein. Beispiele für Einzelprojekte sind z.B. die Visualisierung von Leishmania tarentolae Zellen (Kooperation mit der AG Konthur; Klatt et al., 2013, J. Proteome Res.), Untersuchungen von Streßgranulae in Hela-Zellen nach Behandlung Fluorourazil und Natriumarsenid (Kooperation mit der AG Krobitsch) oder Untersuchungen zur Lokalisation von Proteinen in Mausspermienzellen (Kooperation mit der Abteilung Herrmann). Bespiele für langjährige Kooperationen sind TEM-Untersuchungen zur Differenzierung von Stammzellen (Zusammenarbeit mit J. Adjaye; MPIMG, jetzt Universität Düsseldorf), von Krebszellen (Kooperationen mit M. Schweiger, MPIMG, jetzt Universität Köln) oder anderen Krankheitsprozessen wie z.B. Progerien (Zusammenarbeit mit Björn Fischer-Zirnsak, Forschungsgruppe Mundlos).

Die Mikroskopiegruppe unter Rudi Lurz hat über viele Jahre mit zahlreichen nationalen und internationalen Arbeitsgruppen zu degenerativen Erkrankungen des Gehirns kooperiert (AG Wanker, MDC Berlin; AG Multhaup, FU Berlin). Mica-Absorptionstechniken wurden zur Untersuchung von DNA-Protein-Interaktionen der DNA-Replikation in Bakterien und Hefen eingesetzt (AG Speck, Imperial College, London; AG Zawilak-Pawlik, Institute of Immunology and Experimental Therapy, Wrocław; AG Bravo, CIB, Madrid). Ein weiterer Schwerpunkt lag auf der Analyse von Struktur, Zusammenbau und Infektionsmechanismus des Bakteriophagen SPP1 (Zusammenarbeit u.a. mit P. Tavares, CNRS, Gif-sur-Yvette; P. Boulanger, Université de Paris-Sud, Orsay; C. Breyton, CNRS, Grenoble; M. Loessner, ETH Zürich). SPP1 infiziert B. subtilis und wurde bereits von dem ehemaligen Gründungsdirektor des Instituts, Thomas Trautner, als Modellsystem zur Untersuchung eukaryotischer dsDNA-Viren eingeführt. Einige dieser Kooperation endeten mit der Pensionierung von Rudi Lurz, andere wie beispielsweise die Untersuchungen der DnaA-Bindung an die oriC region in Helicobacter pylori (Donczew et al., 2014, J. Mol. Biol.) oder Kryo-EM Untersuchungen von Assembly-Intermediaten des SPP1-Phagen (Kooperation mit P. Tavares und E. Orlova, Birkbeck College, London) werden bis heute fortgesetzt.

 

Abbildung 1: (A) Die Montage von 1080 TEM-Aufnahmen (26000x Vergrößerung zeigt die Calyx-Region des Drosophila-Gehirns. (B) Zoom in die in (A) markierte Region. Mehrere Boutons sind zu erkennen, von denen einer in (C) vergrößert dargestellt ist und eine aktive Zone zeigt (Pfeil).

In Kooperation mit Stephan Sigrist (FU-Berlin) haben wir Elektronentomographie eingesetzt, um den Einfluss unterschiedlicher Isoformen des “Bruchpilot“-Proteins auf die Bildung von elektronendichten Strukturen, den sogenannten “T-bars“,  an neuromuskulären Verbindungen in Drosophila-Larven zu untersuchen (Matkovic et al., 2013, J Cell Biol). T-bars repräsentieren ein Proteingerüst, das die Freisetzung von synaptischen Vesikeln an präsynaptischen aktiven Zonen strukturiert. Um zu untersuchen, ob in aktiven Zonen alterungsbedingt strukturelle Veränderungen auftreten, haben wir Routinen zu automatischen Datensammlung mittels Leginon (Suloway et al., 2005, J Struct Biol) implementiert. Leginon ermöglicht uns, vollautomatisch Areale von Ultradünnschnitten mit bis zu 500 µm2 mit einer Pixelsize im nm-Bereich abzubilden. Die aufgenommenen Bilder (> 1000 Aufnahmen pro Region) werden anschließend mit FIJI zu einer Montage zusammengesetzt (Abb. 1). Mit dieser Methode konnten wir die gesamte Calyx-Region eines Fliegengehirns abbilden und systematisch nach aktiven Zonen bzw. T-bar Strukturen suchen. Wir konnten zeigen, dass mit zunehmendem Alter der Fliegen statistisch sowohl die Zahl der aktiven Zonen als auch die Dichte der synaptischen Vesikel in Boutons der Calyx-Region abnimmt. Die Gabe von Spermidin - ein biogenes Polyamin, das alterungsbedingten Beeinträchtigungen der Gedächtnisleistung (“age induced memory impairments“, AMI) in Fliegen entgegenwirkt (Gupta et al., 2013, Nature Neuroscience) - konnte diese Veränderungen nicht kompensieren. Stattdessen konnten wir zeigen, dass Spermidin einer alterungsbedingten Zunahme der T-bar Größe und der Erhöhung des Bruchpilotprotein-Anteils in T-bars entgegenwirkt. Diese Ergebnisse belegen, dass automatisierte TEM eine leistungsfähige Methode ist, um strukturelle Veränderungen auf Ultrastrukturebene zu analysieren (Gupta et al., 2017, PLoS Biol).

 

Abbildung 2: Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie. Links: Überlagerung einer konfokalen fluoresenzmikroskopischen Aufnahme und einer TEM-Montage (480 Aufnahmen, 15000x Vergrößerung) eines immunogold-markierten Ultradünnschnitts von humanen iPCS-Zellen. Zur Lokalisierung des stammzell-spezifischen Markerproteins TRA1-60 wurde ein sekundärer Antikörper verwendet, der sowohl mit dem Fluoreszenzfarbstoff Alexa488 (grün) und 5 nm Immunogold-Beads konjugiert ist. Blau: DAPI-Färbung der Zellkerne. Rechts: Zoom in die markierte Region der TEM-Montage. Immunogold-markierte TRA1-60 Moleküle (Pfeile) sind deutlich zu erkennen.

In Kooperation mit J. Adjaye (Universität Düsseldorf) haben wir automatisierte TEM-Datensammlung eingesetzt, um die Differenzierung von induzierten pluripotenden Stammzellen (iPSCs) zu untersuchen. Hier konnten wir zeigen, dass aus iPSC gewonnene Zellen ab dem hepatischen Endoderm-Stadium tatsächlich Gallenkanälchen (Bile canaliculi), ein für Leberzellen charakteristisches ultrastrukturelles Merkmal, ausbilden. In einer vergleichbaren Studie konnten wir zeigen, das aus Fibroblasten von Patienten gewonnene iPSCs, die möglicherweise als Modellsystem zur Analyse seltener mtDNA-assoziierten genetischen Erkrankungen dienen können, nach Differenzierung zu neuronalen Vorläuferzellen typische Merkmale wie z.B. die Gestalt von neuronalen Zellen aufweisen (Kooperation mit A. Prigione, MDC Berlin, Lorenz et al., 2017, Cell Stem Cell).

Fluoreszenzmikroskopische Methoden zählen mittlerweile zu den Standardmethoden der Zellbiologie zur Lokalisation von Proteinen in der Zelle. Nach Abbe ist die Auflösung konventioneller lichtmikroskopischer Methoden jedoch durch die Wellenlänge des Lichts begrenzt (µm-Bereich). Elektronenmikroskopie bietet eine deutlich bessere Auflösung, allerdings ist die Vorbereitung biologischer Proben zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Um die Stärken von licht- und elektronenmikroskopischen Methoden zu kombinieren, arbeiten wir an der Implementierung korrelativer Methoden. In ersten Experimenten konnten wir beispielsweise das stammzell-spezifische Markerprotein TRA1-60 sowohl mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie als auch mit Immunogold-Markierung in Ultradünnschnitten lokalisieren (Abb.2). Darüber hinaus versuchen wir korrelative Methoden inklusive Tokuyasu-Kryo-Schneidetechniken zur Visualisierung von Krebszellen aus Zellkulturen oder Xenocraft-Tumormodellen zu etablieren (Kooperationen u.a. mit M. Schweiger, Universität Köln und G. Schönfelder, Bundesinstitut für Risikobewertung, Berlin).

 

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